如何使用cell ranger進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組定量分析，針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，這篇文章詳細(xì)介紹了相對(duì)應(yīng)的分析和解答，希望可以幫助更多想解決這個(gè)問(wèn)題的小伙伴找到更簡(jiǎn)單易行的方法。

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在RNA_seq數(shù)據(jù)的定量分析中，都是首先將reads比對(duì)到參考基因組，然后再使用定量軟件進(jìn)行定量，比如經(jīng)典的hisat+stringTie的分析策略，對(duì)于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組而言，其定量的原理也是一樣的，只不過(guò)由于引入了UMI標(biāo)簽的設(shè)計(jì)，在定量時(shí)需要考慮相同UMI標(biāo)簽來(lái)自同一個(gè)轉(zhuǎn)錄本，直接使用傳統(tǒng)的分析軟件就不合適了。

官方提供的cell ranger軟件不僅提供了數(shù)據(jù)拆分，也提供了定量等分析內(nèi)容。

定量的前提都是需要將reads比對(duì)到參考基因組上，對(duì)于比對(duì)而言，第一步都是先對(duì)參考基因組建立索引，官網(wǎng)提供了人和小鼠的參考基因組供下載，網(wǎng)址如下

https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest

對(duì)于其他物種，我們只需要有基因組的fasta文件和轉(zhuǎn)錄本的gtf文件，就可以自定義參考基因組，步驟如下

1. 對(duì)GTF文件進(jìn)行過(guò)濾

在原始的GTF文件中，會(huì)包含非常多類型的基因，可以通過(guò)mkgtf子命令，篩選其中感興趣的基因，用法如下

cellranger mkgtf \
hg38.ensembl.gtf \
hg38.ensembl.filtered.gtf \
--attribute=gene_biotype:protein_coding

通過(guò)attribute屬性來(lái)篩選，上述例子中只篩選出蛋白編碼基因?qū)?yīng)的記錄。

2. 建立索引

通過(guò)mkref子命令來(lái)建索引，用法如下

cellranger mkref \
--genome=output_genome \
--nthreads=10 \
--fasta=input.fa \
--genes=input.gtf

genome參數(shù)指定輸出結(jié)果的目錄，建好索引之后的目錄結(jié)構(gòu)如下

.
├── fasta
│   ├── genome.fa
│   └── genome.fa.fai
├── genes
│   └── genes.gtf
├── pickle
│   └── genes.pickle
├── reference.json
└── star

可以看到，cell ranger對(duì)基因組建立了STAR的索引，然后通過(guò)STAR將reads比對(duì)到參考基因組上。

定量分析通過(guò)count子命令實(shí)現(xiàn)，用法如下

cellranger count \
--id=sample345 \
--transcriptome=database_path \
--fastqs=fastq_path \
--sample=mysample \

id參數(shù)指定輸出目錄的名字,transcriptome參數(shù)指定基因組索引所在目錄，fastqs指定mkfastq命令產(chǎn)生的序列文件所在目錄，sample參數(shù)指定需要分析的樣本，在fastq_path下對(duì)應(yīng)一個(gè)子目錄。

count子命令不僅可以進(jìn)行定量分析，還提供了聚類，PCA, tSNE等一系列分析結(jié)果，輸出結(jié)果目的錄下文件很多，在后續(xù)我們會(huì)詳細(xì)解讀該命令的輸出結(jié)果。

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